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    ELISA试剂盒操作流程及技术要点

    酶联免疫吸附测定(ELISA)是指将可溶性的抗原或抗体结合到固相载体上,利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。

    本讲以双抗体夹心法为例,详细阐述ELISA的操作流程及技术要点,希望对科研朋友的实验有所帮助。

    双抗体夹心法

     

    1. 试剂配制

    1.1 标准品

    ① 从试剂盒中取出一支标准品,于6000-10000rpm离心30秒。用1mL样本稀释液溶解,并用枪头对准冻存管底部反复吸打5次以助溶解,充分混匀得到标准品S7,放置备用。

    ② 取7个1.5mL 离心管(S0-S6)依次排列,各加入250µL样本稀释液。吸取250µL 标准品S7到第一个离心管中(S6),轻轻吹打混匀。从S6中吸取250µL到第二个EP管中(S5),轻轻吹打混匀。以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为样本稀释液。

    编号 S7 S6 S5 S4 S3 S2 S1 S0
    pg/mL 2000 1000 500 250 125 62.5 31.25 0

    1.2 洗液工作液

    浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。例如用量筒量取240mL去离子水,倒入烧杯或其他洁净容器中,再量取10mL浓洗涤液,均匀加入,搅拌混匀,在临用前配妥。浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。


    1.3 生物素标记抗体工作液

    生物素标记抗体液按1:100倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释。如10μL生物素标记抗体加990μL生物素标记抗体稀释液,轻轻混匀,在临用前10分钟内配妥。


    1.4 辣根过氧化物酶标记亲和素工作液

    辣根过氧化物酶标记亲和素按1:100倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行稀释。如10μL辣根过氧化物酶标记亲和素加990μL辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液,轻轻混匀,在临用前10分钟内配妥。


     

    2. 重要提示

    1、实验开始前,请提前配置好所有试剂。试剂或样本稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。

    2、用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便管盖和管壁上的液体集中到管底。

    3、在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。

    4、因实际装量多于标示装量,配制工作试剂请用精准的计量工具(移液枪或量筒等)量取,切勿不经量取直接使用

    5、标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制,实际配制时应多配制0.1-0.4mL。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。

    6、标准品的稀释请勿于板中进行,标准品应于临用前15分钟内配制。为保证实验有效性,建议每次实验使用新的标准品。若保存得当,溶解后的标准品S7可在2-8℃保存,7天内使用有效。


     

    3. 操作步骤

    1、将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30分钟,按前述方法配制试剂,备用。

    2、加样:分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μL,轻轻晃动混匀,覆上板贴,37℃温育2小时

    3、弃去液体,甩干,不用洗涤。

    4、每孔加生物素标记抗体工作液100μL,覆上新的板贴,37℃温育1小时。

    5、弃去孔内液体,甩干,洗板3次。每次浸泡2分钟,200μL/每孔,甩干。

    6、每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL,覆上新的板贴,37℃温育1小时。

    7、弃去孔内液体,甩干,洗板5次。每次浸泡2分钟,200μL/每孔,甩干。

    8、依序每孔加底物溶液90μL,37℃避光显色15-30分钟。

    9、依序每孔加终止溶液50μL,终止反应。

    10、在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。


     

    4. 操作要点

    1、为保证检测结果的准确性,建议标准品及样本均设双孔测定。每次检测均需做标准曲线

    2、如标本中待测物质含量过高,请先用样本稀释液进行稀释,以使样本符合试剂盒的检测范围,最后计算时再乘以相应的稀释倍数。

    3、加样:加样时,请使用一次性的洁净吸头,避免交叉污染。加样时应尽量轻缓,避免起泡,将样本加于酶标板孔底部,切勿沿孔壁加样。一次加样时间最好控制在10分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

    4、温育:为防止样本蒸发或污染,温育过程中酶标板必须覆上板贴,实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。温育过程中应随时观察温箱温度是否恒定于37℃,及时调整。温育过程中,温箱不易开启太多次,以免影响温度平衡。

    5、洗涤:洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。

    手工洗板方法:吸去(不可触及孔壁和孔底)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液按200μL/孔注入孔内,浸泡2分钟。根据操作步骤中所述,重复此过程数次。

    自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

    6、显色:为保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间观察一下显色情况以控制反应时间(比如每隔10分钟)。当肉眼可见标准品前3-4孔有明显梯度蓝色,后3-4孔显色不明显时,即可加入终止液终止反应,此时蓝色立刻变为黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

    7、底物溶液应为浅蓝色或无色,如果颜色严重变深则必须弃用。底物溶液易受污染,请避光妥善保存。



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